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液相色譜儀硅膠色譜柱清洗方法與技巧

點(diǎn)擊次數:2763  更新時(shí)間:2015-12-09

液相色譜儀檢測分析過(guò)程中,硅膠色譜柱上被吸附的樣品成分累積到一定程度時(shí),就開(kāi)始形成新的固定相。新的檢測物質(zhì)能與殘留雜質(zhì)作用形成一定的分離機理,從而導致保留時(shí)間波動(dòng),出現拖尾現象。隨著(zhù)時(shí)間的積累,色譜柱的反壓就會(huì )超過(guò)泵所能承受的zui大壓力,使色譜柱無(wú)法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。
    再生被污染的液相色譜柱的關(guān)鍵是了解污染物的性質(zhì)并且找到適當的溶劑來(lái)清除。如果污染是因為重復進(jìn)樣時(shí)強保留物質(zhì)的累積引起的,可用90~100%較強的溶劑沖洗20個(gè)體積可以清除污染物。例如,柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果使用的是緩沖液系統,不要直接切換到強溶劑,突然轉換到高濃度有機溶劑可能會(huì )使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀,這樣會(huì )導致更大的問(wèn)題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉軸失靈。應該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相(即把緩沖液換成水)沖洗5~10個(gè)體積以后才更換強溶劑。
    有時(shí)候,強溶劑也沒(méi)法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要使用更強的溶劑或者多重溶劑來(lái)清洗柱子。一般來(lái)說(shuō),所有的清洗方法都有類(lèi)似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加,經(jīng)常zui后一個(gè)溶劑是非常疏水的(如醋酸乙酯),可以用來(lái)溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類(lèi)。在使用多重溶劑時(shí),須保證每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過(guò)程要結束時(shí),必須借助一個(gè)中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統。例如,異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑,因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大,必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。當然,如果使用紫外檢測器的話(huà),避免溶劑在紫外區域有吸收,要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線(xiàn)平穩。
硅膠鍵合柱常用的緩沖溶液可使用以下溶劑:100%甲醇、100%乙腈、75%乙腈-25%異丙醇、100%異丙醇、100%二氯甲烷、100%正己烷。用二氯甲烷或正己烷以后,由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來(lái)的水相溶劑,每種溶劑至少沖洗10個(gè)柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱,可以用1~2ml/min的流速來(lái)沖洗,要回復原來(lái)的溶劑體系,不需要每一步都沖洗,可以跳過(guò)中間步驟。中間步驟可使用異丙醇,然后用沒(méi)有緩沖的流動(dòng)相,zui后回復起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種教常用的去除污染的溶劑。如果色譜柱被嚴重污染,可以二甲基亞砜或者二甲基甲酰銨和水按50:50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過(guò)色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過(guò)程,溶劑沖洗可以利用梯度洗脫系統操作;還有一個(gè)問(wèn)題是清洗過(guò)程中是否可以反沖HPLC色譜柱,因為大多數強保留的污染物都會(huì )累積在柱頭,把柱子反過(guò)來(lái)可以縮短污染物被沖出柱子的移動(dòng)距離??紤]到裝填柱子的穩定性,現在大多數HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的,因此他們的柱床應該不會(huì )受到反方向流速的影響。但是,如果頭上的燒結比尾部的燒結孔徑大的話(huà)。例如尾部燒結的孔徑是2μm,通常能夠留住平均5μm孔徑里的填料。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線(xiàn)的zui小粒徑時(shí),有些填料能穿過(guò)這些縫隙而流出色譜柱,這樣會(huì )導致空白出現。
清洗色譜柱的頻率主要看有多少強保留物質(zhì)流經(jīng)色譜柱,因為反相柱有時(shí)候在分辨率消失或者鬼峰出現前能承受很大的污染,使用者經(jīng)常會(huì )等到出現了異常情況才開(kāi)始注意。然而,污染物過(guò)多的累積會(huì )導致清洗柱子的難度加大。所以,經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時(shí),應當有規律地清洗柱子。

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